Коллектив ученых из МФТИ создал метод для культивирования фрагментов человеческой сетчатки в лабораторных условиях.
Эта технология даст возможность оценивать эффективность вирусных векторов для генной терапии еще до начала дорогих испытаний на животных, что ускорит и упростит разработку методов лечения слепоты, связанной с дегенерацией фоторецепторов. Фрагменты сетчатки берутся посмертно у доноров и затем подвергаются культивированию. На таких моделях можно тестировать новые вирусы-доставщики и платформы, которые считаются перспективными для генной терапии. Однако ученым предстоит решить ряд задач, связанных с особенностями таких моделей, чтобы ускорить внедрение новых методов лечения слепоты в клиническую практику.
Сетчатка «из пробирки»
Специалисты Центра живых систем МФТИ предложили многообещающую модель для генной терапии слепоты — культивированные в лабораторных условиях фрагменты донорской сетчатки. Как объяснили эксперты, основой многих современных подходов к лечению наследственных заболеваний является оптогенетическая генная терапия: с помощью безопасного вируса в клетки сетчатки вводятся гены, которые кодируют светочувствительные белки. Эти белки, внедренные в оставшиеся нейроны, возвращают им способность реагировать на свет, частично компенсируя утраченные фоторецепторы.
Основная проблема заключается в том, что доклиническая оценка новых вирусных векторов традиционно осуществляется на животных моделях и клеточных культурах. Однако результаты, полученные на мышах, крысах или даже приматах, зачастую плохо воспроизводятся в человеческом глазу. Вследствие этого многообещающий вектор, показавший хороший тропизм (сродство к определенным типам клеток) у животных, может оказаться неэффективным или даже токсичным для человека. Кроме того, такие эксперименты требуют значительного времени, средств и вызывают этические вопросы.
— Наш подход, основанный на культивировании эксплантатов из донорской сетчатки, позволяет непосредственно изучать взаимодействие вирусных векторов с тканью человека, сохраняя при этом сложную архитектуру и типы клеток. Однако этот метод включает в себя несколько сложных ключевых этапов, — отметил руководитель группы генной терапии ретинопатии, научный сотрудник лаборатории геномной инженерии МФТИ Алсаллум Алмакдад.
В течение шести часов после смерти донора необходимо извлечь сетчатку и отделить ее от пигментного эпителия и стекловидного тела. Затем с помощью специального круглого пробойника диаметром 5 или 8 мм из разных областей вырезают одинаковые фрагменты. Эти фрагменты помещаются на мембранные вставки с порами 0,4 микрона в специальный питательный раствор. Сетчатка не погружается в раствор полностью, а остается на границе раздела сред: питательные вещества поступают снизу через поры, а доступ воздуха обеспечивается сверху. Такой подход позволяет создать условия, близкие к естественным, благодаря чему ткань сохраняет жизнеспособность до двух недель.
— Выделяя сетчатку и затем культивируя, мы с помощью создания специальной среды можем максимально сохранить ее жизнеспособность. Это позволяет проверять на конкретном органе новые ассоциированные вирусы или лентивирусы, либо новые платформы, которые считаются хорошими кандидатами для генной терапии. Достаточно на первый или второй день после выделения капнуть этих кандидатов буквально на сетчатку и подождать 7−14 дней, чтобы они проникли в конкретные клетки. Затем образцы направляют на гистологию или с помощью флюоресцентности определяют, где находятся вирусы и на какие клетки они в итоге нацелились, — прокомментировал Алсаллум Алмакдад.
Таким образом, это довольно экономный и эффективный метод скрининга новой терапии, резюмировал специалист. Технологию уже можно применять в лабораторной практике. Метод имеет свои ограничения, но, по сути, исследователи создали биологический «стенд» для испытаний, который значительно ближе к реальности, чем стандартные клеточные культуры. Это ускорит разработку терапии для таких заболеваний, как пигментный ретинит, болезнь Штаргардта и возрастная макулярная дегенерация, от которых страдают миллионы людей по всему миру.
Перспективы создания новых методов генной терапии слепоты
В офтальмологии известно множество тяжелых заболеваний сетчатки, которые приводят к инвалидизации. Это серьезная социальная проблема во всем мире, и до сих пор она остается нерешенной. Ученые уже не первое десятилетие пытаются найти подходы, которые могли бы помочь таким пациентам. Здесь и препараты, и стволовые клетки, и зрительные протезы, и оптогенетика. Последняя может потенциально помочь тысячам абсолютно слепых людей вернуть часть зрительных функций. Однако пока нет надежных методов, которые можно было бы эффективно и широко внедрять в клиническую практику.
— Поэтому любой инструмент, который позволит ускорить эксперименты, имеет высокую ценность. Если у ученых появится возможность увеличить частоту итераций в экспериментах и использовать более объективные методы контроля результата, это должно приблизить науку к тому, чтобы помочь многим слепым людям, — отметил специалист.
Метод культивирования клеток сетчатки и выращивания из них трехмерных органоидов — одно из самых значительных достижений в офтальмологии. Он позволяет лучше понять процессы, происходящие в сетчатке, и найти подходы к лечению заболеваний, которые считались неизлечимыми. Ранее использовали двухмерные структуры в чашке Петри, но сейчас поняли, что трехмерные более жизнеспособны, самоорганизуются, обмениваются информацией и всё больше напоминают сложную организацию настоящей сетчатки. До сих пор новые фармакологические вещества можно было тестировать преимущественно на животных, однако строение их глаза существенно отличается от человеческого, что создавало барьер. Проведение таких исследований на живых людях невозможно. Объемные структуры позволяют изучать механизмы заболеваний и тестировать различные воздействия — вирусные векторы, препараты, новые молекулы. Это ближайшее будущее, методы которого уже активно используют.
Однако, по его словам, есть определенные сложности: процесс занимает минимум полгода, в органоиде отсутствуют сосуды и иммунные клетки, не полностью воссоздается структура сетчатки, так как макула, центральная зона и периферия имеют различия. Поэтому перед учеными стоят амбициозные задачи в этом направлении. А внедрение новых методов генной терапии слепоты в клиническую практику по-прежнему может занять годы.
Исследование опубликовано в издательстве Springer Nature Link как часть книги Retinal Gene Therapy: Methods and Protocols.
Фото: hi-tech.mail.ru